无核（或少核）是柑橘果实品质优良的重要标志，而雄性不育是柑橘果实无核的重要原因之一。目前柑橘雄性不育机理解析多数停留在细胞学、转录组、蛋白组及小RNA组学等层面，对调控柑橘雄性不育关键基因的深入研究较少。植物保守的miRNA-靶基因组合miR399-PHOSPHATE2（PHO2）在植物中主要调控磷平衡，该功能在拟南芥、水稻等作物高度保守。除调控磷平衡外，miR399-PHO2还参与糖代谢，多种营养饥饿响应，盐、旱、ABA信号及开花期调控。但miR399在植物花器官发育和雄性育性调控方面鲜有报道。
近日，华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室郭文武教授在国际学术期刊Plant Physiology在线发表了题为“The miR399-CsUBC24module regulates reproductive development and male fertility in citrus”的研究论文。该研究表明miR399-CsUBC24在柑橘中除调控磷平衡的保守功能外，还调控柑橘花器官发育和雄性不育。该研究发现了miR399-CsUBC24的新功能，揭示了柑橘雄性不育新机理。
课题组在前期柑橘细胞工程与遗传改良工作中，以可育的HB柚为叶肉原生质体亲本，以胞质雄性不育品种‘国庆1号’温州蜜柑为愈伤原生质体亲本，原生质体融合创制出胞质杂种新品种‘华柚2号’。该胞质杂种的细胞核基因组和叶绿体基因组来自叶肉融合亲本HB柚，线粒体基因组来自愈伤组织融合亲本‘国庆1号’温州蜜柑；遗传上类似叶肉融合亲本HB柚的雄性不育突变体。该胞质杂种花器官异常、雄性不育、果实无核。小RNA高通量测序比较分析发现，相对于可育亲本HB柚，miR399家族6个成员均在‘华柚2号’花器官3个连续发育时期持续下调表达。由此推测CsmiR399可能参与柑橘生殖发育。miR399家族6个成员中，CsmiR399a.1在柚花器官丰度最高，推测CsmiR399a.1下调与柑橘花器官发育和花粉育性密切相关。
图1 CsmiR399a.1下调导致山金柑花器官发育异常和花粉育性下降
研究人员在柑橘本物种的模式植物—山金柑超表达miR399a.1的短串联靶基因模拟（STTM）片段以抑制miR399a.1表达，创制出11株阳性苗。阳性苗生长20个月后稳定开花，表型鉴定发现miR399a.1-STTM山金柑表现典型的缺磷症状—主根生长受抑制，侧根变多等，且磷饥饿响应基因（如PTH家族、PHO1、PAPs和PHR1）表达异常，说明miR399-UBC24在柑橘中具有调控磷平衡的保守功能。此外，miR399a.1-STTM山金柑花瓣变小变少，花药减少，花药开裂受到抑制，花粉淀粉代谢异常，花药淀粉代谢关键基因表达水平异常，花粉育性显著下降（图1），果实种子数显著减少。为了解析miR399a.1调控柑橘花发育及花粉育性的机理，验证了CsUBC24(PHO2)是miR399a.1介导抑制表达的靶基因。进一步研究发现，CsUBC24与调控花发育的SEPALLATAMADS box转录因子家族（CsSEP1.1，CsSEP1.2和CsSEP3）和调控气孔发育的转录因子INDUCER OF CBF EXPRESSION 1（ICE1）蛋白互作，并影响花发育关键基因LATE MERISTEM IDENTITY2 (CsLMI2)表达。综上所述，miR399-UBC24可能通过调控SEP家族影响花器官发育，并通过ICE1调控气孔发育进而影响花药开裂（图2）。
图2 CsmiR399a.1-CsUBC24调控柑橘花器官发育和雄性不育的机理
华中农业大学2017级果树学博士研究生王蓉为该论文第一作者，郭文武教授和伍小萌副教授为论文通讯作者，邓秀新院士、方燕妮博士等参与了研究工作。该研究依托华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室平台，受到国家重点研发计划项目（no. 2018YFD1000106）、国家自然科学基金（nos. 31530065, 31701891）等项目资助。
论文链接:http://www.plantphysiol.org/content/early/2020/06/08/pp.20.00129
作者：王 蓉
审核：伍小萌
